NEB T4 DNA連接酶protocol:
1、在微型離心管(冰上)中設(shè)置以下反應(yīng):
(T4 DNA連接酶應(yīng)最后添加。注意:表中顯示了使用1mol:3mol插入zhi定DNA大小的載體的連接。)
成分 | 20 μl 反應(yīng) |
T4 DNA連接酶緩沖液 (10X)* | 2 μl |
載體 DNA (4 kb) | 50 ng (0.020 pmol) |
Insert DNA (1 kb) | 37.5 ng (0.060 pmol) |
無核酸酶水 | to 20 μl |
T4 DNA 連接酶 | 1 μl |
**注意:T4 DNA連接酶緩沖液應(yīng)在室溫下解凍并重懸。
2、通過吸管上下輕輕混合反應(yīng)物,并短暫地進(jìn)行微量離心。
3、對(duì)于粘性(粘性)末端,在16°C下孵育過夜或室溫下孵育10分鐘。
4、對(duì)于鈍端或單堿基懸突,在16°C下孵育過夜或室溫下孵育2小時(shí)(或者,高濃度T4 DNA連接酶可用于10分鐘的連接)。
5、在65°C下加熱滅活10分鐘。
6、在冰上冷卻,將1-5μl的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為50μl的感受態(tài)細(xì)胞。
NEB T4 DNA連接酶使用時(shí)的注意事項(xiàng):
1、ATP 是反應(yīng)中必不ke少的輔因子。這與需要 NAD 作為輔因子的 E. coli DNA 連接酶不同。
2、若需稀釋 T4 DNA 連接酶,推薦使用含 50% 甘油的貯存緩沖液(稀釋緩沖液 A,NEB #B8001S)稀釋,然后于 -20℃ 貯存。如稀釋后立即使用,也可以使用 1X T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液稀釋。
3、連接反應(yīng)可以在添加 1 mM ATP 的四種限制性內(nèi)切酶緩沖液的任何一種或在 T4 多聚核苷酸激酶(T4 PNK)緩沖液中進(jìn)行。
4、室溫連接。
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