一般流程

1.用聚乙烯亞胺或多聚賴氨酸涂覆蓋玻片，在室溫下放置 1 小時。

2. 用無菌水充分漂洗蓋玻片3 次，每次1 小時。

3. 充分干燥蓋玻片，在紫外光下滅菌少4 小時。

4. 使細胞在玻璃蓋玻片上生長。

5. 用磷酸鹽緩沖液(PBS) 簡單漂洗。 推薦使用1 × PBS 0.1% Tween 20 作為洗滌緩沖液。

固定 

可使用以下兩種方法中的一種固定細胞： 

1.室溫下，在100% 甲醇（-20 ℃ 冷凍）中孵育細胞5 分鐘。

2. 室溫下，在4% 多聚甲醛（溶于 PBS 中，pH 7.4）中孵育細胞 10 分鐘。 用冰PBS 洗滌細胞3 次。 

抗原修復（可選步驟） 

在抗原修復緩沖液對細胞進行加熱處理后，有些抗體的效果會更好。查看產品信息，了解每種一抗的使用建議。

1. 將抗原修復緩沖液（100 mM Tris，5% [w/v] 尿素，pH 9.5）預熱 95 ℃。具體方法為：將裝有緩沖液的蓋玻片染色缸置于水浴鍋中，水浴鍋的溫度設 為 95 ℃。

2. 用小型寬頭鑷子小心將蓋玻片置于蓋玻片染色缸內的抗原修復緩沖液中，記下長 有細胞的蓋玻片面。 

3. 在 95 ℃ 下加熱蓋玻片10 分鐘。 

4. 從抗原修復緩沖液中取出蓋玻片，浸入 6 孔組織培養(yǎng)板內的PBS 溶液中，保持 長有細胞的一面朝上。 

5. 用 PBS 洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。 

通透 

1.如果靶蛋白位于細胞內，對細胞進行通透處理尤為關鍵。用甲醇固定的樣品不需要進行 通透處理。 用PBS（含 0.1–0.25% Triton X-100 或 100 μM Digitonin 或 0.5% Saponin）孵育樣品10 分鐘。Triton X-100 是用于提高抗體滲透性*常用的 去垢劑。但 Triton X-100 會破壞細胞膜，因此不適用于細胞膜抗原。

2.確定每種目標蛋白的Triton X-100 佳比例。

3.用 PBS 洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。 

封閉與免疫染色 

1.用 1% BSA、22.52 mg/mL 甘氨酸的PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育細 胞30 分鐘，封閉抗體的非特異性結合（可替代的封閉液包括 1% 明膠或來源于產生 二抗的物種的10% 血清：查看抗體數(shù)據表了解相關建議）。

2.室溫下，用稀釋抗體（溶于 1% BSA 的PBST 中）在濕盒中孵育細胞1 小時， 或4 ℃ 過夜孵育。倒出溶液，用PBS 洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。

3.室溫下，用二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細胞1 小時。

4.倒出二抗溶液，用PBS 避光洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。

多色染色（可選步驟）

要檢測同一個樣品中兩種或多種抗原的共同分布情況，需要使用雙重免疫熒光流程。該流程可在混合物中同時進行檢測，也可逐個抗原依次進行檢測。 

確保抗體來源于不同物種并且這些抗體有相應的二抗。例如，抗抗原 A 的兔抗體和抗抗 原B 的鼠抗體。也可使用偶聯(lián)不同熒光團的直標一抗。

同時孵育

1. 用封閉液孵育細胞30 分鐘。

2. 室溫下，用兩種一抗（溶于 1% BSA 的PBST 中）在濕盒中孵育細胞1 小 時，或4 ℃ 過夜孵育。

3. 倒出溶液，用PBS 洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。

4. 室溫下，用兩種二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細胞1 小時。

5. 倒出二抗溶液，用PBS 避光洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。

依次孵育 

1. 第一封閉步驟：室溫下，用第一封閉液（來源于產生二抗的物種的 10% 血 清）孵育細胞 30 分鐘。

2. 室溫下，用第一種一抗（溶于 1% BSA 或 1% 血清的PBST 中）在濕盒中孵 育細胞1 小時，或4 ℃ 過夜孵育（一抗溶于 1% 明膠或 1% BSA 的PBST 中）。

3. 倒出第一種一抗溶液，用PBS 洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。

4. 室溫下，用第一種二抗（溶于 1% BSA 的PBST 中）避光孵育細胞1 小時。

5. 倒出第一種二抗溶液，用PBS 避光洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。

6. 第二封閉步驟：室溫下，用第二種血清（來源于產生二抗的物種的 10% 血 清）避光孵育細胞30 分鐘。

7. 室溫下，用第二種一抗（溶于 1% BSA 或 1% 血清的PBST 中）在濕盒中避 光孵育細胞1 小時，或4 ℃ 過夜孵育。

8. 倒出第二種一抗溶液，用PBS 避光洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。

9. 室溫下，用第二種二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細胞1 小時。

倒出第二種二抗溶液，用PBS 避光洗滌細胞3 次，每次5 分鐘。 

如需檢測兩種以上的抗原，其余抗體按照步驟1–5 繼續(xù)操作

復染 

1.用 0.1-1 μg/mL Hoechst 或 DAPI（DNA 染色）孵育細胞 1 分鐘。

2. 用 PBS 漂洗細胞。

封片 

1. 用一滴封片介質封閉蓋玻片。 

2. 用指甲油密封蓋玻片，避免樣品變干和在顯微鏡下移動。 

3. -20 ℃ 或 4 ℃ 下避光保存。