本文主要介紹穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的原理、步驟,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能夠得到穩(wěn)定高表達的細(xì)胞株,是滿足活性蛋白大量制備的方法。
利用哺乳動物系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白的方式有兩種:瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。使用哺乳動物細(xì)胞表達蛋白,細(xì)胞的選擇培養(yǎng)也不可忽視。常用的有中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)和人胚腎細(xì)胞(HEK293)。德泰生物主要培養(yǎng)HEK293用于哺乳動物細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染,CHO細(xì)胞用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通過穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建篩選出能夠穩(wěn)定表達的細(xì)胞株。針對瞬時轉(zhuǎn)染,外源基因在短時間轉(zhuǎn)錄翻譯得到的蛋白量少,1mg質(zhì)粒得到1mg蛋白,能夠滿足小量蛋白制備,大量生產(chǎn)成本很高。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的是將外源基因整合到細(xì)胞自身的基因組上,隨著細(xì)胞的生長分裂外源基因可以穩(wěn)定表達,同時經(jīng)過抗生素加壓篩選,終得到能夠穩(wěn)定表達蛋白的細(xì)胞株。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過程
1.細(xì)胞復(fù)蘇
細(xì)胞復(fù)蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細(xì)胞株解凍并重新培養(yǎng)的過程。細(xì)胞復(fù)蘇的關(guān)鍵是快復(fù),防止在解凍過程中,產(chǎn)生的水珠形成冰晶損傷細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇一般步驟如下:
1)預(yù)先加熱水浴鍋,溫度37-40℃,并在離心管中準(zhǔn)備好10ml培養(yǎng)基
2)從液氮罐或冰箱中取出細(xì)胞,迅速放進預(yù)熱的水浴鍋中,鑷子夾住凍存管晃動,使其受熱均勻
3)當(dāng)凍存管內(nèi)*融化時,注意用酒精擦拭凍存管消毒,將液體倒入含有10ml培養(yǎng)基的離心管中
4)離心5min,去除上清,得到沉淀
5)用培養(yǎng)基懸浮沉淀,并接種到培養(yǎng)瓶常規(guī)培養(yǎng)
細(xì)胞復(fù)蘇后,生長一段時間,95%的細(xì)胞貼壁生長,細(xì)胞狀態(tài)良好,說明細(xì)胞復(fù)蘇成功。
2.瞬時轉(zhuǎn)染
以Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑為例的操作流程,不同轉(zhuǎn)染試劑參考說明書
1)將復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞按照1-3x10^5接種到6孔板中,加入2-4ml的*培養(yǎng)基,混勻放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜
2)無菌狀態(tài)下配置如下溶液:a 用100ul的無血清培養(yǎng)基稀釋2ug的待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒
b 用100ul的無血清培養(yǎng)基稀釋25ul的Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑(血清的存在會影響轉(zhuǎn)染效率,因此要使用無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染)
3)將ab溶液混合并搖勻,室溫下放置30min左右
4)細(xì)胞培養(yǎng)80%單層左右,用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次,每孔加入1ml的無血清培養(yǎng)基,并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔,按十字方向輕搖混勻,二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時
5)將轉(zhuǎn)染液倒出,換為*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)
3.穩(wěn)定細(xì)胞系篩選
24-72h加入選擇性抗生素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株,預(yù)實驗確定抗生素的濃度,確定抗生素對所選細(xì)胞的低作用濃度。
1)提前一天接種細(xì)胞與24孔板中,待第二天長成25%單層為宜,二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)。
2)第二天將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基,抗生素濃度按梯度遞增(0,50,100,200,400,800,1000ug/ml)。
3)培養(yǎng)15天左右絕大多數(shù)細(xì)胞死亡抗生素濃度為準(zhǔn),一般為400-800ug/ml,篩選細(xì)胞時刻適當(dāng)提高濃度
4)二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72h后按照1:10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代,使用預(yù)實驗得到的抗生素濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)。后挑選單克隆,有限稀釋法挑取單克隆。
有限稀釋法:將細(xì)胞消化下來做連續(xù)的10倍稀釋,每稀釋一梯度都在9孔板中培養(yǎng),生長一周左右再次挑取單克隆進行培養(yǎng),如此反復(fù)3次。
5)Western blot或ELISA檢測蛋白的表達情況,挑取多個單克隆進行表達檢測,篩選出表達量的克隆傳代并保存。
終篩選出穩(wěn)定高表達目的基因的細(xì)胞株,相對于瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建節(jié)約大量的時間和成本,是滿足活性蛋白大量制備的方法。